Erkunden Sie die PhosphoSens-Technologie zur präzisen Messung der Kinase- und Phosphatase-Aktivität
Erfahren Sie, wie die PhosphoSens®-Technologie eine Lösung zur präzisen Messung der Kinase- und Phosphatase-Aktivität bietet und Forschern dabei hilft, ihr Verständnis der zellulären Signalübertragung und der therapeutischen Entwicklung zu verbessern.
Die Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen sind grundlegende biochemische Prozesse, die zelluläre Funktionen wie Signaltransduktion, Zellzyklusprogression, Stoffwechsel und Genexpression regulieren. Diese Prozesse werden durch zwei Enzymklassen katalysiert: Kinase und Phosphatase.
Protein-Kinasen sind Enzyme, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung zellulärer Funktionen spielen (Cheng et al., 2011). Diese Enzyme sind an Prozessen wie Zellwachstum, Differenzierung, Stoffwechsel, Proliferation und programmiertem Zelltod beteiligt (Shchemelinin et al., 2006). Das menschliche Genom codiert 518 verschiedene Protein-Kinasen, was sie zu einer der größten Enzymfamilien im Körper macht (Manning et al., 2002). Aufgrund ihrer entscheidenden Rolle in der zellulären Signalgebung werden Störungen in der Kinase-Aktivität mit vielen Krankheiten, einschließlich Krebs und anderen Erkrankungen, in Verbindung gebracht.
Protein-Phosphatasen sind Enzyme, die eine wichtige Rolle bei der Zellregulation spielen, indem sie Phosphatgruppen von phosphorylierten Aminosäureresten auf Proteinen entfernen. Sie werden in verschiedene Familien unterteilt, basierend auf ihrer Struktur und ihren katalytischen Mechanismen.
Um Protein-Kinasen und -Phosphatasen besser zu verstehen und wirksame Therapien zu entwickeln, ist es wichtig, ihre Aktivität genau zu messen. Hier kommen Tools wie die AssayQuant’s PhosphoSens Kinase und Phosphatase Assays ins Spiel. Diese Plattform ermöglicht eine genaue und empfindliche Detektion der Kinase- und Phosphatase-Aktivität, die sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die therapeutische Entwicklung unerlässlich ist.
PhosphoSens® Technologie
Der Kern der PhosphoSens® Technologie basiert auf der Chelation-Enhanced Fluorescence (ChEF) Methode. Diese Methode verwendet eine synthetische Aminosäure mit einem 8-Hydroxychinolinderivat (Sulfonamidooxine, Sox). Sox bindet an Magnesiumionen (Mg²⁺) und interagiert mit den Phosphorylierungsstellen auf den Kinase-Substraten.
Im nicht-phosphorylierten Zustand hat Sox eine geringe Affinität für Mg²⁺, was zu einer minimalen Fluoreszenz führt. Sobald das Substrat jedoch phosphoryliert wird, steigt die Affinität von Sox für Mg²⁺, was zu einem starken Fluoreszenzsignal führt. Diese Fluoreszenz kann dann mit gängigen Fluoreszenz-Plattenlesern überwacht werden, was eine einfache Quantifizierung der Kinase-Aktivität ermöglicht (Abbildung 1).
Abbildung 1: ChEF Mechanismus zur direkten Messung der Protein-Kinase-Aktivität
Abbildung 2A zeigt typische Fluoreszenzänderungen nach der Phosphorylierung eines PhosphoSens Peptid-Substrats und Abbildung 2B zeigt die Anregungs- und Emissionsspektren eines typischen phosphorylierten PhosphoSens Peptids. Die Fluoreszenz-Eigenschaften des mit 8-Hydroxychinolin koordinierten Mg(II)-Ions von Sox haben eine λExMax von ~360 nm (358-363 nm) und eine λEmMax von ~492 nm (485-498 nm). Da das Fluoreszenz-Emissionsspektrum relativ breit ist (siehe Abbildung 2B), kann die Fluoreszenz-Emission im Bereich von 475-508 nm mit einer Signalintensitätsminderung von <7% überwacht werden.
Abbildung 2: Fluoreszenzspektren der PhosphoSens Peptide
PhosphoSens® Kinase und Phosphatase
PhosphoSens® Kits, die CSox Peptid-Substrate enthalten, sind mit verschiedenen Kinase-Typen kompatibel, sowohl mit gereinigten als auch mit solchen, die in komplexen biologischen Proben vorhanden sind. Diese Flexibilität macht PhosphoSens® zu einem hervorragenden Werkzeug für verschiedene Forschungsanwendungen, von der Kinase-Inhibitor-Screening bis hin zur Analyse des Einflusses von Kinase-Mutationen.
Für Phosphatase-Assays verwendet PhosphoSens® einen ähnlichen Ansatz mit CSox-basierten Phosphopeptiden. Diese Assays sind ebenfalls homogen, kontinuierlich und hochsensitiv und liefern zuverlässige Daten für das Studium der Phosphatase-Aktivität in physiologischen Bedingungen.
PhosphoSens® bietet eine einfache, aber leistungsstarke Lösung zur Messung der Kinase- und Phosphatase-Aktivität in verschiedenen biologischen Kontexten. Ob Sie Kinase-Inhibitoren untersuchen, Kinase-Mutationen analysieren oder die Regulierung von Phosphatasen erforschen, PhosphoSens® bietet zuverlässige, effiziente und genaue Ergebnisse. Indem es diese komplexen Messungen vereinfacht, hilft PhosphoSens® Forschern, die Geheimnisse der zellulären Signalgebung zu entschlüsseln und ebnet den Weg für die Entwicklung gezielter therapeutischer Wirkstoffe.
Literaturverzeichnis
Cheng, H.C., Qi, R.Z., Paudel, H. und Zhu, H.J., 2011. Regulation und Funktion von Protein-Kinasen und -Phosphatasen. Enzyme research, 2011, S. 794089.
Shchemelinin, I., Sefc, L. und Necas, E., 2006. Protein-Kinasen, ihre Funktion und ihre Bedeutung bei Krebs und anderen Krankheiten. Folia biologica, 52(3), S. 81.
Manning, G., Whyte, D.B., Martinez, R., Hunter, T. und Sudarsanam, S., 2002. Das Protein-Kinase-Kontingent des menschlichen Genoms. Science, 298(5600), S. 1912-1934.