NeoLux; Viability assessment by loss of efflux protein function

 Die patentierte NeoLUX-Technologie ist ein Lebenszellentest, der den Zustand der Homöostase oder Zellschädigung durch Fluoreszenzauslesung misst. Die Technologie wurde für einen hohen Durchsatz auf 96- und 384-Well-Platten optimiert und eignet sich für handelsübliche Fluoreszenz-Lesegeräte. Das sehr einfache Protokoll beschränkt sich auf die Zugabe des Fluoreszenzmarkers in das Kulturmedium und zwei Fluoreszenzmessungen.
Die NeoLUX basiert auf der Fotoinduktion eines Biosensors, der ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Dieser Fluoreszenzanstieg wird nur bei Zellen in Homöostase vor der Zugabe des Biosensors beobachtet. Die Berechnung des Fluoreszenzverhältnisses vor und nach der LED-Bestrahlung führt zu einer genauen und dosisabhängigen Messung des Zustands der zellulären Schädigung, die auf eine durch die Probe verursachte chemische oder physikalische Toxizität folgt.

NeoLux-Testmethode Prinzip

Das experimentelle Verfahren ist einfach. Der TO-Biosensor wird in das Zellkulturmedium gegeben und fluoresziert nach der Assoziation mit den Zellnukleinsäuren. Wenn TO durch LED-Beleuchtung bei 480 nm photoaktiviert wird, geht seine Relaxation mit einer Energieübertragung auf das intrazelluläre Dioxygenmolekül (3O2) einher, was zur Produktion von Singulett-Sauerstoff (1O2) und einer Kaskade von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) einschließlich Superoxidanion (O2.-) und Hydroxylradikal (OH.) führt (siehe Abb. 1). Die antioxidative Wirkung einer Substanz kann dann anhand ihrer Fähigkeit gemessen werden, dieser intrazellulären ROS-Produktion entgegenzuwirken.

Dosis-Wirkungs-Kurven 

Die intrazelluläre antioxidative Wirkung zeigt sich durch eine zeitliche Verzögerung des Fluoreszenzanstiegs, der durch die LED-abhängige Photoaktivierung von TO ausgelöst wird. Abbildung 2 zeigt die Fluoreszenzprofile menschlicher HepG2-Zellen, die 4 Stunden lang mit verschiedenen Resveratrol-Konzentrationen behandelt wurden. Resveratrol ist ein starkes zelluläres Antioxidans, das dafür bekannt ist, dass es sowohl als ROS-Fänger als auch als Auslöser der durch den Nrf2-Signalweg gesteuerten natürlichen Zellabwehr wirkt. Die Kurve der (unbehandelten) Kontrolle ist in Schwarz dargestellt. Die Unterschiede zwischen den Flächen unter den Kurven (AUC) der Kontrolle und der Probe ermöglichen die Erstellung eines Index, der die intrazelluläre antioxidative Wirkung der Probe qualifiziert.

EC50 und andere Parameter, die antioxidative Wirkungen aufzeigen

Die Berechnung des NeoLux-Index bei verschiedenen Probenkonzentrationen ermöglicht die Erstellung von Dosis-Wirkungs-Profilen, die gut mit der sigmoiden Regression übereinstimmen und die Bewertung des EC10 (Wirksamkeitskonzentration 10 %, Schwellenwert der zellulären Wirkung), des Standard-EC50 (Wirksamkeitskonzentration 50 %) und des EC90 (Wirksamkeitskonzentration 90 %, schwächste Dosis, bei der die Verbindung mit maximaler Wirkung wirkt) ermöglichen. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für die Dosis-Wirkungs-Kurven, die nach einer 1- und 4-stündigen Behandlung mit Resveratrol an menschlichen HepG2-Zellen erhalten wurden.

NeoLux: ein vielseitiges Testverfahren

Ganz allgemein liefern die NeoLux-Fluoreszenzprofile Informationen über mehrere Parameter, die für die getestete Probe und das gewählte Zellmodell spezifisch sind. Neben der oben beschriebenen antioxidativen Wirkung zeigt der NeoLux-Test auch pro-oxidative Effekte (Linksverschiebung des Probenprofils) und zytotoxische Effekte (hohe Anfangsfluoreszenz und nicht wirksame Beleuchtung) auf (Abbildung 4), was der Methode einen zusätzlichen Wert verleiht. Bemerkenswert ist auch, dass die NeoLux-Technologie bei allen Arten von eukaryotischen (Tiere, Pflanzen, Pilze) und prokaryotischen (Bakterien) Zellmodellen funktioniert.

Merkmale

• Für 1000 oder 4000 Messpunkte in 96-Well-Platten
• Ein-Schritt-Verfahren
• Kein Waschen
• Standardverfahren für die meisten Zelllinien (bei Bedarf ist ein Optimierungskit erhältlich)
• Angepasst an Zelllinien, hiPSCs, Primärzellen,...
• 1 Lösung im Kit (Biosensor muss im Kulturmedium verdünnt werden)
• Lagerung: 4°C
• Zeit bis zum Verfall: 6 Monate
• Auch für 384-w-Platten erhältlich.

Mechanismus

Das Verfahren wird als Light-up Cell System bezeichnet, weil die Fluoreszenz des fluoreszierenden Biosensors während seiner Photoinduktion durch Beleuchtung ansteigt. Der Biosensor dringt passiv in die Zellen ein, wird aber durch Efflux-Transportproteine schnell aus den funktionierenden Zellen entfernt, was zu einem geringen Fluoreszenzsignal führt. Bei Lichteinfall werden durch die Photoinduktion des Biosensors intrazelluläre ROS erzeugt, die die Zellhomöostase oder die Fähigkeit der Zelle, den Biosensor freizusetzen, verändern und seinen massiven Eintritt in die Zellen auslösen, was zu einem erhöhten Fluoreszenzsignal führt. Wurden die Zellen zuvor mit einer toxischen Substanz inkubiert, was zu einer Veränderung des Efflux oder anderer zellulärer Funktionen führt, tritt der Biosensor massiv ein, was zu einem hohen Fluoreszenzsignal führt, das sich nach der Lichteinwirkung nicht erhöht.

 Sicherheit

Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke und nicht für den menschlichen oder therapeutischen Gebrauch bestimmt. Potenziell schädlich. Längere oder wiederholte Exposition vermeiden. Nicht in die Augen, auf die Haut oder auf die Kleidung gelangen lassen. Nach der Handhabung gründlich waschen. Bei Augen- oder Hautkontakt die betroffenen Stellen 15 Minuten lang mit reichlich Wasser waschen und einen Arzt aufsuchen. Bei Einatmen oder Verschlucken die Person an die frische Luft bringen und sofort einen Arzt aufsuchen.

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